腓肠神经营养动脉逆行岛状皮瓣修复下肢远端皮肤缺损
作者：马勇光 王侠 李健宁 夏有辰 秦荣生 李东
单位：100083 北京医科大学第三临床医院成形外科
关键词：下肢腓肠神经；营养动脉；岛状皮瓣；下肢
癌症990105
【摘要】目的：探讨巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在骨巨细胞瘤(GCT)形成及其溶骨中的作用。方法：运用免疫组化方法和细胞培养技术，观察M-CSF、IL-1和TNF-α在18例GCT中的表达及其对GCT溶骨的影响。结果：在GCT中，M-CSF主要由纤维母细胞样基质细胞(FC)分泌；巨噬细胞样基质细胞(HC)主要分泌IL-1和TNF-α，少数多核巨细胞(MGC)也可产生TNF-α。外源性的TNF-α能加强GCT中FC对骨质的破坏。结论：GCT中HC和MGC分泌的IL-1和TNF-α，可以刺激FC的溶骨和浸润性的生长，从而增强GCT侵袭性的生物学行为。而FC产生的M-CSF可能促进了GCT中MGC的形成。
, 百拇医药
中图号：R738.1；R361.3
Study on expression and significance of M-CSF、IL-1、TNF-α in giant cell tumor of bone
Xie Dan Wen Jianming Wu Huixi, et al
Department of Pathology, Sun Yat-Sen University of Medical Science, (Guangzhou, 510080)
【Abstract】 Purpose: To investigate the role of Macrophage colonstimulating factors (M-CSF), Interleukin-1 (IL-1) and Tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the formation of giant cell tumor (GCT) of bone and it's bone resorption. Method: Immunohistochemical method and Cell culture technique was used to detect the expression and bone resorpted function of M-CSF, IL-1 and TNF-α in GCT. Results: In GCT, M-CSF was mainly secreted by fibroblast-like stromal cells (FC). Histocyte-like stromal cells (HC) had the ability to secrte IL-1 and TNF-α . Some of the multinucleated giant cells (MGC) could also produce TNF-α . The addition of exogenous TNF-α could promote bone resorption of FC in vitro. Conclusion: In GCT, the cytokines of TNF-α and IL-1 that secreted by HC and MGC could stimulate bone resortion of FC and it's invasive growth, as to enhance GCT's invading biological behaviors. The production of M-CSF by FC might play a role in the formation of MGC in GCT.
, 百拇医药
Key words: Giant cell tumor; M-CSF; IL-1; TNF-α; Immunohistochemistry
骨巨细胞瘤(GCT)是一种具有潜在恶性的骨肿瘤，局部主要表现为溶骨性的病变。在GCT中，破骨细胞样多核巨细胞和单核基质细胞的并存，始终是它典型的特征。Burmester认为：GCT的各细胞成分可能是骨髓原始间叶细胞向破骨细胞分化过程中不同阶段的细胞[1]。在生理情况下，M-CSF能促使长期培养的骨髓间质细胞形成破骨细胞[2]，IL-1和TNF-α能促进破骨细胞的成熟与骨质的吸收[3，4]。然而，在以破骨细胞为特征的GCT中，是否也有细胞分泌上述因子，维持和刺激其自身的形成及对骨质的破坏，至今未见文献报道。本实验采用免疫组化方法和细胞培养技术，观察M-CSF、IL-1、TNF-α在18例GCT中的表达及其对GCT骨质破坏作用的影响，以从细胞因子的角度，探讨它们在GCT形成及其溶骨中的作用。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1对象
18例骨巨细胞瘤手术标本取自1994年10月至1997年5月中山医科大学第一附属医院骨科，病理分级均为Ⅰ～Ⅱ级。
1.2试剂(详见附表)
附表 第一抗体的稀释度和切片情况 抗体
厂家
稀释度
切片
M-CSF
GENZYME
1∶50
, http://www.100md.com
冰冻切片
IL-1
DACO
1∶100
冰冻切片
TNF-α
GENZYME
1∶100
冰冻切片
LCA
DACO
1∶100
冰冻切片
, http://www.100md.com
LCA：白细胞共同抗原
1.3方法
1.3.1M-CSF、IL-1、TNF-α+LCA双重免疫组化染色：M-CSF、IL-1、TNF-α免疫组织化学单染采用LSAB法，进行DAB显色反应，阳性反应为棕色。完成上述单染程序至DAB显色后，将切片放入400ml的微波处理液(0.01mol/L)枸橼酸缓冲液，pH6.0)，置微波炉内，以最大功率加热煮沸10分钟，以完全灭活第一次加入的M-CSF、IL-1、TNF-α抗体和复合物的活性。加入稀释的LCA抗体，置4℃过夜。检测系统为APAAP试剂盒(DAKOK681)，按说明书操作。显色剂为固蓝(fastbule)或固红(fastred)，阳性反应为蓝色或红色。
1.3.2细胞培养与处理：将原代GCT细胞常规培养，传代20次以上，得到一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)，用于实验。另各装两瓶5×106个FC，分别加入含5×10-9mol/L的TNF-α和2ng/ml的IL-1新鲜培养液，处理72小时，胰酶消化用于实验。
, 百拇医药
1.3.3溶骨模型的制备与观察：选取同胎生、大小重量相当的6天龄NIH小鼠，处死取左右对称的圆碟形颅顶骨(直径0.5cm)，于微波炉中煮沸3分钟后，分别置于96孔培养板的孔内，凹面朝上，随机分为配对的实验组和对照组。将105个用IL-1或TNF-α处理的FC加入实验组骨片上，对照组加入105个未经处理的FC，置孵箱中常规培养，7天后取出各配对组骨片，作HE切片并观察骨质破坏情况。
2 结果
2.1GCT中M-CSF、IL-1、TNF-α和LCA双重免疫组化染色结果
M-CSF与LCA的免疫双染显示：部分单核基质细胞及多核巨细胞呈LCA胞膜阳性(染成红色)，而M-CSF主要存在于LCA阴性的单核基质细胞中，聚集在胞膜周围，染成棕色，多核巨细胞均未见M-CSF阳性反应(图1)。
, 百拇医药
图1 骨巨细胞瘤M-CSF和LCA免疫组化：示部分单核基质细胞呈M-CSF胞膜阳性(棕黄色)(
)；而另一部分单核基质细胞及多核巨细胞呈LCA胞膜阳性(暗红色)(
)。×100
IL-1、TNF-α与LCA的免疫双染均显示：部分单核基质细胞呈蓝色的LCA与棕色的IL-1或TNF-α双重膜阳性反应(图2)。部分多核巨细胞呈TNF-α核阳性，染成棕色(图3)。
图2 骨巨细胞瘤IL-1和LCA免疫组化：示部分单核基质细胞胞膜呈IL-1(棕色)和LCA(蓝色)双重阳性()。×200
, http://www.100md.com
图3 骨巨细胞瘤TNF-α免疫组化：示部分多核巨细胞呈TNF-α胞核阳性(棕色()。×200
2.2GCT中FC细胞的培养
18例GCT培养细胞中，有11例培养成功，其中的多核巨细胞和巨噬细胞样基质细胞在不断传代中消失，传代20次以上，得到一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)，贴壁生长(图4)；另7例因污染而培养失败。
图4 骨巨细胞瘤第20代培养细胞：细胞呈一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)：贴壁生长。×50
2.3FC细胞体外溶骨模型中的形态学观察
, 百拇医药
GCT对照组中的FC细胞均呈3至5层贴附骨片的凹面上，相接之处骨面呈锯齿状骨质破坏(图5)；而经TNF-α处理后的FC细胞生长更为旺盛，呈6至10层贴附骨片上，骨质明显溶解变薄，破坏程度较对照组更为明显(图6)。但IL-1处理后的FC细胞组的溶骨效应与对照组均无明显差异。
图5 骨巨细胞瘤FC溶骨：细胞均呈3至5层贴附骨片的凹面上，相接之处骨面呈锯齿状骨质破坏。×100
图6 骨巨细胞瘤经TNF-α处理后的FC溶骨：细胞呈6至10层贴附骨片上，骨质明显溶解变薄，破坏程度较对照组(图5)更为明显。×100
3 讨论
骨巨细胞瘤(GCT)是一种常见的骨肿瘤，具有局部侵袭性破坏骨质、复发和转移的潜在恶性特征。GCT在病理形态上是由多核巨细胞(MGC)和单核基质细胞(Stc)组成。超微结构观察发现，Stc主要有两种类型：巨噬细胞样基质细胞(HC)和纤维母细胞样基质细胞(FC)。FC是一种早期未分化细胞，是GCT中唯一能体外长期培养和增殖的细胞[1，5]。HC属于单核-巨噬细胞系早期的未成熟细胞[1]；有人在体外GCT组织的培养中也观察到：HC可以融合成8个核的MGC[6]。
, 百拇医药
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激早期的巨噬细胞向成熟或破骨细胞方向分化[7]。抗M-CSF抗体或抗M-CSF受体抗体均能抑制破骨细胞的形成[8]。我们的双重免疫组化结果显示：M-CSF主要存在于LCA阴性的Stc中，而表达LCA的Stc是GCT中的HC[4]。显然，GCT中的M-CSF主要由FC分泌。由于M-CSF在破骨细胞的生成中至关重要，它能促进具有破骨细胞表型的多核巨细胞形成[2]。我们推测：GCT中FC产生的M-CSF，可能促进了HC的分化并融合成MGC。
不少学者证实：GCT中的MGC具有破骨细胞的特征和溶骨能力[1，9]。白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)同属于破骨细胞活化因子，能促进破骨祖细胞分化为破骨细胞。并增强破骨细胞对骨质的吸收与破坏[2]。然而，我们在溶骨实验中观察到：GCT中的FC同样也可以溶解骨质，而且TNF-α还可以促进FC的增殖及对骨质的破坏。虽然IL-1未能呈现相似的作用，但是，Yasuyaki发现：外源性的IL-1能增加GCT体外培养的FC分泌Ⅳ型胶原酶和基质水解酶[10]。而这些蛋白酶在侵袭性肿瘤的浸润与转移中起着甚为重要的作用。我们的免疫组化证实：在GCT中HC(LCA阳性的单核基质细胞)能分泌IL-1和TNF-α，其中部分MGC也呈TNF-α核阳性，由此我们认为：GCT中HC和MGC分泌的IL-1和TNF-α，可以作用于FC，并刺激其溶骨和浸润性的生长，从而增强GCT侵袭性的生物学行为。
, 百拇医药
*国家教委博士点基金和霍英东教育基金资助课题
参考文献
[1]Burmetser GR, Winchester RJ, Dimistra-Bona A, et al. Delineation of four cell type comprising the giant cell tumor of bone. J Clin Invest 1983, 71:1633.
[2]Macdonald BR, Takahashi N, Mcmaus LM, et al. Formation of multinucleated cells that respond to oseotropic hormone in long term human bone marrow culture. Endocrinology. 1987, 120:2376.
, http://www.100md.com
[3]Bergmann P. Local factor in bone repair. Rev Med Brux, 1989, 10(10):419.
[4]Liu TC, Ji ZM, Wang LT. Giant cell tumor of bone-An immunohistochemical study. Path Res Pract, 1989, 185:448.
[5]Richard OC, Marshall, Mary K, et al. Characterization of a cell line derived from a human giant cell tumor of bone tat stimulates osteoclastic boen resorption. Clin Orthop, 1993, 296:229.
[6]Lu P. Cytological observation on giant cell tumor of bone. Clin Med J, 1984, 97:411.
, 百拇医药
[7]Vase G. Cellular biology and biochemical mechanism of bone resorption. Clin Orthop, 1988, 231:239.
[8]Tanaka S, Takahashi N, Udagawa N, et ao. Effects of parathyroid hormone (PTH) related protein and PTH osteoclasts and osteoclast precursors in vivo. Endocrinology, 1995, 136:3207.
[9]Chambers TJ, Fuller K, Mcsheely PMJ. The effect of calcium regulating hormones on bone resorption by isolated human osteoclastoma cells. J Pathol, 1985, 145:297.
(收稿：1997-09-30修回：1997-11-06), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三临床医院成形外科
关键词：下肢腓肠神经；营养动脉；岛状皮瓣；下肢
癌症990105
【摘要】目的：探讨巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在骨巨细胞瘤(GCT)形成及其溶骨中的作用。方法：运用免疫组化方法和细胞培养技术，观察M-CSF、IL-1和TNF-α在18例GCT中的表达及其对GCT溶骨的影响。结果：在GCT中，M-CSF主要由纤维母细胞样基质细胞(FC)分泌；巨噬细胞样基质细胞(HC)主要分泌IL-1和TNF-α，少数多核巨细胞(MGC)也可产生TNF-α。外源性的TNF-α能加强GCT中FC对骨质的破坏。结论：GCT中HC和MGC分泌的IL-1和TNF-α，可以刺激FC的溶骨和浸润性的生长，从而增强GCT侵袭性的生物学行为。而FC产生的M-CSF可能促进了GCT中MGC的形成。
, 百拇医药
中图号：R738.1；R361.3
Study on expression and significance of M-CSF、IL-1、TNF-α in giant cell tumor of bone
Xie Dan Wen Jianming Wu Huixi, et al
Department of Pathology, Sun Yat-Sen University of Medical Science, (Guangzhou, 510080)
【Abstract】 Purpose: To investigate the role of Macrophage colonstimulating factors (M-CSF), Interleukin-1 (IL-1) and Tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the formation of giant cell tumor (GCT) of bone and it's bone resorption. Method: Immunohistochemical method and Cell culture technique was used to detect the expression and bone resorpted function of M-CSF, IL-1 and TNF-α in GCT. Results: In GCT, M-CSF was mainly secreted by fibroblast-like stromal cells (FC). Histocyte-like stromal cells (HC) had the ability to secrte IL-1 and TNF-α . Some of the multinucleated giant cells (MGC) could also produce TNF-α . The addition of exogenous TNF-α could promote bone resorption of FC in vitro. Conclusion: In GCT, the cytokines of TNF-α and IL-1 that secreted by HC and MGC could stimulate bone resortion of FC and it's invasive growth, as to enhance GCT's invading biological behaviors. The production of M-CSF by FC might play a role in the formation of MGC in GCT.
, 百拇医药
Key words: Giant cell tumor; M-CSF; IL-1; TNF-α; Immunohistochemistry
骨巨细胞瘤(GCT)是一种具有潜在恶性的骨肿瘤，局部主要表现为溶骨性的病变。在GCT中，破骨细胞样多核巨细胞和单核基质细胞的并存，始终是它典型的特征。Burmester认为：GCT的各细胞成分可能是骨髓原始间叶细胞向破骨细胞分化过程中不同阶段的细胞[1]。在生理情况下，M-CSF能促使长期培养的骨髓间质细胞形成破骨细胞[2]，IL-1和TNF-α能促进破骨细胞的成熟与骨质的吸收[3，4]。然而，在以破骨细胞为特征的GCT中，是否也有细胞分泌上述因子，维持和刺激其自身的形成及对骨质的破坏，至今未见文献报道。本实验采用免疫组化方法和细胞培养技术，观察M-CSF、IL-1、TNF-α在18例GCT中的表达及其对GCT骨质破坏作用的影响，以从细胞因子的角度，探讨它们在GCT形成及其溶骨中的作用。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1对象
18例骨巨细胞瘤手术标本取自1994年10月至1997年5月中山医科大学第一附属医院骨科，病理分级均为Ⅰ～Ⅱ级。
1.2试剂(详见附表)
附表 第一抗体的稀释度和切片情况 抗体
厂家
稀释度
切片
M-CSF
GENZYME
1∶50
, http://www.100md.com
冰冻切片
IL-1
DACO
1∶100
冰冻切片
TNF-α
GENZYME
1∶100
冰冻切片
LCA
DACO
1∶100
冰冻切片
, http://www.100md.com
LCA：白细胞共同抗原
1.3方法
1.3.1M-CSF、IL-1、TNF-α+LCA双重免疫组化染色：M-CSF、IL-1、TNF-α免疫组织化学单染采用LSAB法，进行DAB显色反应，阳性反应为棕色。完成上述单染程序至DAB显色后，将切片放入400ml的微波处理液(0.01mol/L)枸橼酸缓冲液，pH6.0)，置微波炉内，以最大功率加热煮沸10分钟，以完全灭活第一次加入的M-CSF、IL-1、TNF-α抗体和复合物的活性。加入稀释的LCA抗体，置4℃过夜。检测系统为APAAP试剂盒(DAKOK681)，按说明书操作。显色剂为固蓝(fastbule)或固红(fastred)，阳性反应为蓝色或红色。
1.3.2细胞培养与处理：将原代GCT细胞常规培养，传代20次以上，得到一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)，用于实验。另各装两瓶5×106个FC，分别加入含5×10-9mol/L的TNF-α和2ng/ml的IL-1新鲜培养液，处理72小时，胰酶消化用于实验。
, 百拇医药
1.3.3溶骨模型的制备与观察：选取同胎生、大小重量相当的6天龄NIH小鼠，处死取左右对称的圆碟形颅顶骨(直径0.5cm)，于微波炉中煮沸3分钟后，分别置于96孔培养板的孔内，凹面朝上，随机分为配对的实验组和对照组。将105个用IL-1或TNF-α处理的FC加入实验组骨片上，对照组加入105个未经处理的FC，置孵箱中常规培养，7天后取出各配对组骨片，作HE切片并观察骨质破坏情况。
2 结果
2.1GCT中M-CSF、IL-1、TNF-α和LCA双重免疫组化染色结果
M-CSF与LCA的免疫双染显示：部分单核基质细胞及多核巨细胞呈LCA胞膜阳性(染成红色)，而M-CSF主要存在于LCA阴性的单核基质细胞中，聚集在胞膜周围，染成棕色，多核巨细胞均未见M-CSF阳性反应(图1)。
, 百拇医药
图1 骨巨细胞瘤M-CSF和LCA免疫组化：示部分单核基质细胞呈M-CSF胞膜阳性(棕黄色)(
)；而另一部分单核基质细胞及多核巨细胞呈LCA胞膜阳性(暗红色)()。×100IL-1、TNF-α与LCA的免疫双染均显示：部分单核基质细胞呈蓝色的LCA与棕色的IL-1或TNF-α双重膜阳性反应(图2)。部分多核巨细胞呈TNF-α核阳性，染成棕色(图3)。
图2 骨巨细胞瘤IL-1和LCA免疫组化：示部分单核基质细胞胞膜呈IL-1(棕色)和LCA(蓝色)双重阳性(
)。×200, http://www.100md.com
图3 骨巨细胞瘤TNF-α免疫组化：示部分多核巨细胞呈TNF-α胞核阳性(棕色(
)。×2002.2GCT中FC细胞的培养
18例GCT培养细胞中，有11例培养成功，其中的多核巨细胞和巨噬细胞样基质细胞在不断传代中消失，传代20次以上，得到一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)，贴壁生长(图4)；另7例因污染而培养失败。
图4 骨巨细胞瘤第20代培养细胞：细胞呈一致的长梭形的纤维母细胞样基质细胞(FC)：贴壁生长。×50
2.3FC细胞体外溶骨模型中的形态学观察
, 百拇医药
GCT对照组中的FC细胞均呈3至5层贴附骨片的凹面上，相接之处骨面呈锯齿状骨质破坏(图5)；而经TNF-α处理后的FC细胞生长更为旺盛，呈6至10层贴附骨片上，骨质明显溶解变薄，破坏程度较对照组更为明显(图6)。但IL-1处理后的FC细胞组的溶骨效应与对照组均无明显差异。
图5 骨巨细胞瘤FC溶骨：细胞均呈3至5层贴附骨片的凹面上，相接之处骨面呈锯齿状骨质破坏。×100
图6 骨巨细胞瘤经TNF-α处理后的FC溶骨：细胞呈6至10层贴附骨片上，骨质明显溶解变薄，破坏程度较对照组(图5)更为明显。×100
3 讨论
骨巨细胞瘤(GCT)是一种常见的骨肿瘤，具有局部侵袭性破坏骨质、复发和转移的潜在恶性特征。GCT在病理形态上是由多核巨细胞(MGC)和单核基质细胞(Stc)组成。超微结构观察发现，Stc主要有两种类型：巨噬细胞样基质细胞(HC)和纤维母细胞样基质细胞(FC)。FC是一种早期未分化细胞，是GCT中唯一能体外长期培养和增殖的细胞[1，5]。HC属于单核-巨噬细胞系早期的未成熟细胞[1]；有人在体外GCT组织的培养中也观察到：HC可以融合成8个核的MGC[6]。
, 百拇医药
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激早期的巨噬细胞向成熟或破骨细胞方向分化[7]。抗M-CSF抗体或抗M-CSF受体抗体均能抑制破骨细胞的形成[8]。我们的双重免疫组化结果显示：M-CSF主要存在于LCA阴性的Stc中，而表达LCA的Stc是GCT中的HC[4]。显然，GCT中的M-CSF主要由FC分泌。由于M-CSF在破骨细胞的生成中至关重要，它能促进具有破骨细胞表型的多核巨细胞形成[2]。我们推测：GCT中FC产生的M-CSF，可能促进了HC的分化并融合成MGC。
不少学者证实：GCT中的MGC具有破骨细胞的特征和溶骨能力[1，9]。白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)同属于破骨细胞活化因子，能促进破骨祖细胞分化为破骨细胞。并增强破骨细胞对骨质的吸收与破坏[2]。然而，我们在溶骨实验中观察到：GCT中的FC同样也可以溶解骨质，而且TNF-α还可以促进FC的增殖及对骨质的破坏。虽然IL-1未能呈现相似的作用，但是，Yasuyaki发现：外源性的IL-1能增加GCT体外培养的FC分泌Ⅳ型胶原酶和基质水解酶[10]。而这些蛋白酶在侵袭性肿瘤的浸润与转移中起着甚为重要的作用。我们的免疫组化证实：在GCT中HC(LCA阳性的单核基质细胞)能分泌IL-1和TNF-α，其中部分MGC也呈TNF-α核阳性，由此我们认为：GCT中HC和MGC分泌的IL-1和TNF-α，可以作用于FC，并刺激其溶骨和浸润性的生长，从而增强GCT侵袭性的生物学行为。
, 百拇医药
*国家教委博士点基金和霍英东教育基金资助课题
参考文献
[1]Burmetser GR, Winchester RJ, Dimistra-Bona A, et al. Delineation of four cell type comprising the giant cell tumor of bone. J Clin Invest 1983, 71:1633.
[2]Macdonald BR, Takahashi N, Mcmaus LM, et al. Formation of multinucleated cells that respond to oseotropic hormone in long term human bone marrow culture. Endocrinology. 1987, 120:2376.
, http://www.100md.com
[3]Bergmann P. Local factor in bone repair. Rev Med Brux, 1989, 10(10):419.
[4]Liu TC, Ji ZM, Wang LT. Giant cell tumor of bone-An immunohistochemical study. Path Res Pract, 1989, 185:448.
[5]Richard OC, Marshall, Mary K, et al. Characterization of a cell line derived from a human giant cell tumor of bone tat stimulates osteoclastic boen resorption. Clin Orthop, 1993, 296:229.
[6]Lu P. Cytological observation on giant cell tumor of bone. Clin Med J, 1984, 97:411.
, 百拇医药
[7]Vase G. Cellular biology and biochemical mechanism of bone resorption. Clin Orthop, 1988, 231:239.
[8]Tanaka S, Takahashi N, Udagawa N, et ao. Effects of parathyroid hormone (PTH) related protein and PTH osteoclasts and osteoclast precursors in vivo. Endocrinology, 1995, 136:3207.
[9]Chambers TJ, Fuller K, Mcsheely PMJ. The effect of calcium regulating hormones on bone resorption by isolated human osteoclastoma cells. J Pathol, 1985, 145:297.
(收稿：1997-09-30修回：1997-11-06), http://www.100md.com